蛋白质的提取及含量测定实验报告 蛋白质的提取及含量测定实验报告数

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一 实验目的二 实验原理，实验流程以及装置图三 实验设备及材料四 实验方法步骤及注意事项

植物蛋白提取试剂适用于多种植物根，茎，叶及果实等的新鲜或冻存组织。植物组织成分复杂，含有较多酚类物质、多糖、色素、次生代谢物质等，致使植物蛋白质的分离提取变得困难和复杂。本试剂采用优化的试剂和程序，能有效提取多种植物中的可溶性和疏水性蛋白成分，有效去除植物组织所含的多酚、多糖、醌、色素、脂质、次生代谢物质等干扰蛋白质研究的成分，使提取的蛋白质处于蕞佳的活性状态和检测状态，适应于酶学活性测定，单向及双向蛋白电泳，Western Blot和免疫共沉淀分析等蛋白质研究实验。

组成和规格：无色透明的提取试剂50 ml或100 ml。
贮存：4°C，密封避光1年。
用途：提取多种植物组织和细胞的可溶性和疏水性蛋白。如苹果、花生、土豆、烟叶、菠菜、梅花等。

操作步骤：
1. 组织匀浆，必须充分匀浆，此步骤非常关键：
(1) 冻存组织匀浆：预先将研钵置于－20°C ~－70°C冰箱内冷冻。取液氮冻存的植物组织，放入冰冻的研钵内研磨至粉末状，注意使组织一直处于冰冻状态，如组织颜色加深或变黑通常表明组织已融化。将研磨好的组织转移到EP 管中，按每200 mg植物组织加500 ul的比例加提取试剂，混匀后冰上放置20分钟，其间可数次颠倒混匀，以便蛋白溶解。
(2) 新鲜组织匀浆：取新鲜组织放入研钵中，按每200 mg植物组织加500ul的比例加提取试剂，充分研磨使匀浆液中看不到大的块状或片状组织，保证组织研磨破碎。转移至离心管内，冰上放置20分钟。
2. 离心：12000 g离心15分钟，弃去沉淀。蛋白在上清中。
3. 取离心后的上清，转移至新管，立即使用或－70°C冻存。通常上清内植物色素已基本去除，如有少量残留亦不影响蛋白定量及电泳实验。

如进行双向电泳或欲彻底清除色素等杂质可进行以下内骤:
1. 取上清液加入4倍体积的丙酮或甲醇混匀，－20°C至少一小时以充分沉淀蛋白质。
2. 12000g离心15分钟沉淀蛋白。
3. 弃去上清。自然干燥蛋白沉淀，依据试验将沉淀溶于相应的缓冲液。如进行Western Blot 亦可用提取试剂溶解。

常见问题及解决方法：
1. 提取的蛋白量少：
1) 组织蛋白含量较少，如水果等，可增加组织量；
2) 组织匀浆不充分，如纤维较多的组织，破碎较困难，应适当延长匀浆时间；
3) 组织过老或水分丢失致使其干燥，故尽量选用新鲜较嫩的组织；
4) 甲醇或丙酮沉淀后蛋白溶解不充分，应延长溶解时间或使用较强的蛋白溶解剂。

2. 蛋白质量不佳：
1)提取的蛋白有多酚或色素等杂质残留，可重复用丙酮或甲醇沉淀；
2) 蛋白质降解，操作各步骤均应在冰上进行；加入蛋白酶抑制剂。

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